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蛋白分离纯化方法的选择-镍柱亲和纯化

1. 镍柱的选择（公司）

2. 预装柱与否（公司）

3. AKTA蛋白纯化仪器的使用（仪器的操作）

蛋白纯化的5个步骤

1、纯化上样前样品的准备

（破碎缓冲液，破碎时候进行降温；蛋白酶抑制剂防止蛋白降解；细胞裂解液）

2、配制缓冲液（平衡-上样-洗杂-洗脱）

3、脱盐

4、浓缩

5、浓缩管浓缩

测定蛋白的浓度（方法的选择）

1) BSA试剂盒浓度测定

2) BSA蛋白标准测定（使用BSA设置1ug/1.5ug/2ug/2.5ug/3ug/4ug/6ug/8ug这几个蛋白质量梯度）

3) 简单化的仪器测定

蛋白性状的鉴定

1. 分子峰图

2. 非变性胶

3. 电镜

4. DLS

5. 电势

蛋白分离纯化方法-镍柱纯化

1．蛋白溶液与beads-Ni孵育，4℃ 2h，1ml beads 可以承载10mg蛋白；

2．转移混合液至柱中；

3．低浓度咪唑溶液洗掉杂蛋白，根据文献或者经验确定浓度（25mM），重力作用，洗10ml；

4．高浓度咪唑溶液收集目的蛋白溶液；根据文献或者经验确定浓度（250mM）,2ml/tube收集至考马斯亮蓝染色法无明显变蓝为止；

5．完成后，清洗柱子，最后用20%的乙醇进行保存。

蛋白的浓缩

将收集的流穿液使用浓缩管进行浓缩，可以达到富集和换液的作用。

His标签蛋白纯化产品选择

 镍柱纯化蛋白常见问题汇总

1、his标签纯化后，杂带比较多，纯度不够。

原因

解决方案

蛋白的降解条带

在纯化过程中加入足量的蛋白酶抑制剂

非特异结合柱子的杂蛋白

调整结合液的咪唑浓度

杂蛋白与目的蛋白结合

超声前加入去垢剂

2、在纯化过程中，蛋白出现混浊。

原因

解决方案

蛋白在环境中不稳定或蛋白自身不稳定

检查所用缓冲液是否合适，环境温度是否合适，在缓冲液中加入还原剂（DTT）

3、纯化结束后，没收获his标签蛋白，目的蛋白流穿

原因

解决方案

超声功率，破胞条件不充分

调整破胞条件

样本和结合液未结合

检查缓冲液成分，PH等

样本和填料结合不充分

降低流速，延长孵育的时间

组氨酸暴露不完全

改变标签位置，适当增加组氨酸个数

蛋白与金属离子不结合

更换所用例离子的类型

4、蛋白洗脱不完全

原因

解决方案

洗脱条件温和

适当增加咪唑浓度或降低PH

蛋白已经沉淀在柱子上

选用耐受还原剂的填料，在洗脱液中加入适量DTT，改变缓冲液盐浓度

蛋白有其他相互作用，如非特异性疏水性等

在洗脱液中加入非离子型离子去垢剂，增加氯化钠浓度

5、镍柱使用过程中出现棕色

原因

解决方案

缓冲液中有还原剂，如DTT

缓冲液不加DTT或者降低DTT浓度

通常来说DTT对镍柱的颜色和性能有显著影响，一般在使用镍柱时尽量避免溶液中含有DTT。而Cytiva对其Ni Sepharose 6 Fast Flow的填料进行了耐受测试，DTT高达5mM时不会影响Ni Sepharose 6 Fast Flow的结合量或者镍离子脱落。虽然在3mM DTT上柱时填料颜色会发生明显变化，但没有影响填料的性能。

镍柱的日常使用tips

1对于多数的预装镍柱，上样前，样品需要使用0.22um/0.45um滤膜进行过滤或者离心处理，以避免样品中有细胞碎片等固体物质，堵塞柱子。

2、细胞裂解后非常粘稠，有可能是因为DNA、RNA这类核酸物质过多，需要加入核酸酶去除，以降低样品粘稠度，提高上样速度及洗脱效果。

3、柱子在使用过程中，不能超过填料的耐受压力，以免填料被压塌。

4、每次使用结束后，可用5-10倍柱体积的纯水或者结合缓冲液对柱子进行清洗。（如果出现载量严重下降或者压力增加，需要考虑对柱子彻底清洗）。

蛋白纯化-静态孵育

通过上下颠倒混合，或者摇床摇动，使得纯化介质和样品充分混匀，达到用介质吸附目的蛋白的目的。

蛋白纯化-重力法

依靠重力使得样品流经纯化介质，在样品和介质接触过程中，目的蛋白与纯化介质结合。

免疫亲和沉淀

用带有预先固定抗体的介质，捕获细胞裂解上清中的目的蛋白，用于研究目的蛋白间相互作用或者目的蛋白的活性研究。

纯化得到的组分中没有或者很少目的his标签蛋白，怎么回事？

A：若目的his标签蛋白正常表达（使用his标签的抗体进行WB检测），且充分释放上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱；

若his标签蛋白流穿：

样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。

His标签蛋白与填料的结合较弱；降低上样流速或者增加孵育时间；增加his的数量（常用6-10个）

标签未充分暴露，在变性条件下（4-8M尿素或者4-6M盐酸胍）下进行纯化或测试；重新构建克隆，改变His标签位置。

尝试其他的金属离子结合力：如ZN2+CU2+CO2+等。

若his标签蛋白未洗脱：

洗脱条件过于温和：

增加咪唑浓度或者降低洗脱PH（注意PH在4以下时候NI2+会发生脱落）

目的蛋白与填料发生非特异性疏水或其他相互作用；

在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（如2%Triton X-100）或提高NaCl浓度。

目的蛋白杂填料中发生了沉淀；

减少上样量；使用咪唑线性梯度洗脱以降低洗脱得到的蛋白浓度；使用去垢剂或改变NaCl浓度；

在变性条件下（4-8M尿素或者4-6M盐酸胍）下洗脱。

His标签蛋白纯化试验中，常用的缓冲液成分是什么？

建议缓冲溶液成分如下

结合缓冲溶液：

20mM Tris-Hcl,250mM Nacl（避免非特异性吸附），10mM咪唑（提高浓度可以增加纯度但是会降低效率），ph 8.0 可以根据实际情况调节PH。

洗脱缓冲溶液

20mM Tris-Hcl，10mM咪唑，250mM NaCl ph 8.0。

洗脱得到得到的His标签蛋白样品杂带较多，但是纯度不高，应该如何改进？

可以考虑从以下原因与解决方法

Ø 原因：His标签打那笔被部分降解：

添加蛋白酶抑制剂（慎用EDTA）；保持蛋白样品在低温 下操作；缩短呢实验操作时间。

杂蛋白对于金属粒子也有较强的结合

优化结合，洗脱条件（咪唑浓度、Nacl浓度、ph条件等）；

尝试不同金属离子螯合的填料

增加后续的纯化步骤，例如离子交换、凝胶过滤 等；

构建双标签目的蛋白进一步纯化。

Ø 杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱

在细胞破碎前加入去垢剂或者还原剂

提高wash buffer中去垢剂浓度（2% Triton X-100或者2% Tween 20）或者添加甘油（20%以内）以破坏非特异性相互作用；

将缓冲液的盐浓度提高到500mM Nacl.

Ø 洗杂步骤不够充分

重复洗杂的步骤使得洗杂充分

Ø 普通镍柱是否可以在不脱镍的情况下进行清洗？

如果条件温和，可以不脱镍。

去除沉淀或者变性物质，可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或者8M尿素洗涤，然后用5倍柱子体积的缓冲液洗涤。

除去疏水结合的物质，可以唱2倍柱子体积1%的Triton X -100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤。

Ø 镍柱在使用过程中出现了棕色怎么回事？

主要是缓冲液中的DTT的影响，在碱性的缓冲条件下，镍离子会被DTT还原成棕色的沉淀。如果样品或者缓冲液中含有DTT，在上样之前，建议采用不含还原性试剂的空白运行来任何较弱结合的镍离子；当不使用时候，勿将Ni填料含于含还原性试剂的缓冲液中。空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）

1. 5倍柱体积的双蒸水清洗柱子

2. 5倍柱体积的洗脱液洗柱。

3. 10倍柱体积的平衡液平衡。

Ø 普通的镍填料是否可以重复使用？可以使用多少次？

如果维护好的话，填料在有效期内可以一直使用。

如果每次都是纯化相同的蛋白，没必要剥离镍离子重新挂镍离子，一般经过3-5次纯化后可以进行脱镍和再生镍操作。

如果对于实验要求比较高，可以每做一次试验后对填料再生一次。

Ø 镍柱子堵住了怎么办？

柱子发生堵塞，可能是样品中的细胞碎片或者其他杂质颗粒所致，所以样品一定要离心，或者用0.22/0.45的滤膜过滤。

由于大肠杆菌比较难以过滤，如果只用10000g的转速离心后直接上柱子，对于填料的损伤比较大，很容易堵塞柱子（建议40000-50000/30min），如果没有那么大的离心的离心机可以延长离心时间（12000转/20000g）60min

柱子经常发生堵塞会报废（这个时候需要对柱子进行重装）

若果柱子发生堵塞，请及时在位清洗，不成功的话，这可能是筛板堵塞需要更换筛板或者柱子，并在下次上样时候优化的样品处理方法。对于预装柱或者填料，请做好日常的清洗和维护，具体操作方法可以参考说明书。

若柱子出现反压增高了，请进行彻底的在位清洗CIP。

 Ni-IDA:三齿配位，三个位点结合组氨酸，结合标签能力最强，但是镍离子相对容易脱落，产生非特异吸附，严格按照要求配置缓冲液成分。结合标签能力最强；配基相对容易脱落，产生一些非特异性吸附，严格按照配制缓冲液成分。

NI-NTA：四齿配位，留下两个位点与组氨酸配位

Ni-TED:五齿配位，只留下一个位点与组氨酸配位，因此结合his标签能力显著低于其他的两种;镍离子不容易脱落；结合his能力显著降低；

目前最常用的Ni填料：Ni-IDA和Ni-NTA

使用填料之前，细读产品说明书

主要从化学稳定性、试剂兼容性、平衡液、洗脱液配方等等，进行详细阅读。

避免重组蛋白交叉污染，使用新的填料，洗脱镍后再挂金属离子。平衡前可以用高浓度咪唑清理柱体。一般2-3个CV。

柱体积CV计算方法：πr2*h，可以利用πr方乘以柱高来计算。

使用几次后发现镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异性结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱方法无法彻底清洗所致。建议采用不同的清洗方法来提高载量。

由于NaOH的清洁效果最好，一般按说明书中的操作方先脱镍在进行清洁。

一、脱镍

二、用5-10倍柱子体积的脱镍缓冲液，如50mMPB,500mM NaCl.200mM EDTA ph 7.0)进行脱镍操作。

三、冲洗：用5-10倍柱体积的平衡 （清除EDTA），最后用5-10倍柱体积的双蒸水冲洗。

四、清洗

清洗操作

一般试验使用洗脱缓冲液冲洗即可

去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5M Nacl溶液，然后按照10倍柱体积的双蒸水冲洗。

去除沉淀或者变性蛋白，可以使用1M氢氧化钠溶液，接触1-2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水进行冲洗。

去除疏水性蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍 柱体积的双蒸水洗涤。

各类Buffer:

溶液过酸或者过于碱性的话会造成填料上的镍离子的脱落

后期可以调节的是PH和咪唑浓度

一般先确定咪唑的范围浓度

结合buffer:20mMTris ,0.3M Nacl,5-20mM咪唑，ph7.4；

平衡柱子，缓冲液和盐浓度及ph最好和样本一致。

洗脱buffer:20mM Tris,0.3M Nacl,50-500mM咪唑，ph 7.4，纯化为之蛋白可以设置梯度。

Buffer洗脱

a. Wash buffer 洗10CV，用离心管接收流出液写好标签wash：（Wash buffer:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl）

b. 5mM咪唑，洗10CV，用离心管接收流出液写好标签5mM：（5mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，5mM咪唑）

c. 10mM咪唑，洗10CV，用离心管接收流出液写好标签10mM：（10mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，10mM咪唑）

d. 20mM咪唑，洗10CV，用离心管接收流出液写好标签20mM：（20mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，20mM咪唑）

e. 50mM咪唑，洗10CV，用离心管接收流出液写好标签20mM：（50mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，50mM咪唑）

f. 300mM咪唑，洗10CV，用离心管接收流出液写好，标签300mM：（300mM咪唑:20mM Tris-Hcl PH 8.0,500mM Nacl，300mM咪唑,300mM 1/2/3/4/5/6/7/8/9/10